Split- och poolsyntes
Split- och poolsyntesen (split-mix) är en metod inom kombinatorisk kemi som kan användas för att framställa kombinatoriska föreningsbibliotek. Det är en stegvis , mycket effektiv process som realiseras i upprepade cykler. Proceduren gör det möjligt att framställa miljontals eller till och med biljoner föreningar som blandningar som kan användas i läkemedelsforskning .
Historia
Enligt traditionella metoder syntetiseras de flesta organiska föreningar en efter en från byggstenar som kopplar ihop dem efter varandra på ett stegvis sätt. Före 1982 drömde ingen ens om att göra hundratals eller tusentals föreningar i en enda process. Att inte tala om miljoner eller ens biljoner. Så produktiviteten hos split- och poolmetoden som uppfanns av prof. Á. Furka (Eötvös Loránd University Budapest Ungern), 1982 verkade vid första anblicken otrolig. Metoden hade beskrivits i ett dokument som notariserades samma år. Dokumentet är skrivet på ungerska och översatt till engelska. Motiv som ledde till uppfinningen finns i en tidning från 2002 och metoden publicerades först på internationella kongresser 1988 och sedan i tryck 1991.
Splitt- och poolsyntesen och dess funktioner
Splitt- och poolsyntesen (S&P-syntesen) skiljer sig från traditionella syntetiska metoder. Den viktiga nyheten är användningen av sammansatta blandningar i processen. Detta är anledningen till dess oöverträffade höga produktivitet. Med metoden kan en enskild kemist göra fler föreningar på en vecka än alla kemister som producerats under hela kemins historia. S&P-syntesen tillämpas på ett stegvis sätt genom att upprepa tre operationer i varje steg i processen:
- Dela en sammansatt blandning i lika delar
- Koppla en annan byggsten (BB) till varje del
- Blanda och blanda delarna noggrant
Den ursprungliga metoden är baserad på fastfassyntesen av Merrifield. Proceduren illustreras i figuren av det strömmande diagrammet som visar en tvåcykelsyntes med samma tre BB i båda cyklerna. Att välja fastfasmetoden i S&P-syntesen är rimligt eftersom det annars skulle vara mycket svårt att avlägsna biprodukterna från blandningen av föreningar.
Effektivitet
Den höga effektiviteten är den viktigaste egenskapen hos metoden. I en syntes med flera steg (n) med lika antal BB:er (k) i varje steg är antalet komponenter i ett bildande kombinatoriskt bibliotek (N):
N=k n
Detta innebär att antalet komponenter ökar exponentiellt med antalet steg (cykler) medan antalet nödvändiga kopplingar endast ökar linjärt. Om ett annat antal byggnads-BB:er används i cyklerna (k1, k2, k3...kn) är antalet formade komponenter:
N=ki .k 2 .k 3 ... k n .
Denna egenskap hos proceduren erbjuder möjligheten att syntetisera ett praktiskt taget obegränsat antal föreningar. Till exempel, om 1000 BBs används i fyra cykler förväntas 1 biljon föreningar bildas. Antalet nödvändiga kopplingar är endast 4000!
Anledningen till den höga effektiviteten
Förklaringen till den extraordinära effektiviteten är användningen av blandningar i de syntetiska stegen. Om i en traditionell reaktion kopplas en förening med en reaktant och en ny förening bildas. Om en blandning av föreningar som innehåller n komponenter kopplas till en enda reaktant är antalet nya föreningar som bildas i den enkla kopplingen n. Skillnaden mellan den traditionella och split- och poolsyntesen visas på ett övertygande sätt av antalet kopplingssteg i den traditionella och split- och poolsyntesen av 3,2 miljoner pentapeptider.
Konventionell syntes: 3 200 000x5=16 000 000 kopplingssteg ca 40 000 år S&P syntes: 20x5=100 kopplingssteg ca 5 dagar
Det är möjligt att utföra det konventionella syntesrationella sättet som visas i figuren. I det här fallet är antalet kopplingscykler:
20+400+8 000+160 000+3 200 000=3 368 420 ca 9 200 år
Den teoretiska övre gränsen för antalet komponenter
Som ofta nämnts gör split and pool-metoden det möjligt att syntetisera ett obegränsat antal föreningar. Faktum är att det teoretiska maximala antalet komponenter beror på mängden av biblioteket uttryckt i mol. Om till exempel 1 mol bibliotek syntetiseras är det maximala antalet komponenter lika med Avogadro-talet:
6,02214076·10 23
I ett sådant bibliotek skulle varje komponent representeras av en enda molekyl.
Komponenter i biblioteket bildas i lika molära kvantiteter
Så långt som kemin hos kopplingarna gör det möjligt att komponenterna i biblioteken bildas i nästan lika molär kvantitet. Detta görs möjligt genom att dela upp blandningarna i lika stora prover och genom homogenisering av de sammanslagna proverna genom att blanda dem noggrant. Den lika molära mängden komponenter i biblioteket är mycket viktig med tanke på deras tillämpbarhet. Förekomsten av föreningar i olika mängder kan leda till svårigheter att utvärdera resultaten vid screening. Fastfasmetoden gör det möjligt att använda reagens i överskott för att driva reaktionerna nära slutförandet eftersom överskottet lätt kan avlägsnas genom filtrering.
Möjligheten att använda två blandningar i syntesen
I princip kan användningen av två blandningar i S&P-syntesen leda till samma kombinatoriska bibliotek som bildas i den vanliga S&P-metoden. Skillnaderna i BBs reaktivitet medför dock stora skillnader i koncentrationerna av komponenter, och skillnaderna förväntas öka efter varje steg. Även om en avsevärd mängd arbete skulle kunna sparas genom att använda metoden med två blandningar när ett stort antal BBs kopplas i varje position, är det tillrådligt att hålla fast vid det normalt använda S&P-förfarandet.
Närvaron av alla strukturella varianter i biblioteket
Bildandet av alla strukturella varianter som kan härledas från BBs är ett viktigt inslag i S&P-syntesen. Endast S&P-metoden kan uppnå detta i en enda process. Å andra sidan säkerställer närvaron av alla möjliga strukturella varianter i ett bibliotek att biblioteket är ett kombinatoriskt och framställs genom kombinatorisk syntes.
Bildning av en förening i pärlorna
Konsekvensen av att använda en enda BB i kopplingar är bildandet av en enda förening i varje pärla. Bildandet av OBOC-bibliotek är en inneboende egenskap hos S&P-syntesen. Orsaken förklaras i figuren. Strukturen av föreningen som bildas i en pärla beror på reaktionskärlen i vilka pärlan råkar förekomma i syntetisk väg. Det beror på kemistens beslut att använda biblioteket i den bundna (OBOC) formen eller klyva ner föreningarna från pärlorna och använda det som en lösning.
Realisering av split- och poolsyntesen
Splitt- och poolsyntesen applicerades först för att framställa peptidbibliotek på fast bärare. Syntesen realiserades i en hemmagjord manuell enhet som visas i figuren. Anordningen har ett rör med 20 hål till vilka reaktionskärl kan fästas. Ena änden av röret är kopplad till en avfallsbehållare och en vattenpump. Vänster visar laddning och filtrering, höger kopplingsskakläge. Under de första åren av kombinatorisk kemi konstruerades och kommersialiserades en automatisk maskin vid AdvancedChemTech (Louisville KY USA). Alla operationer i S&P-syntesen utförs automatiskt under datorkontroll. För närvarande finns Titan 357 automatiska synthesizer tillgänglig på aapptec (Louisville KY, USA).
Kodad split- och poolsyntes
Även om det i S&P-syntesen bildas en enda förening på varje pärla är dess struktur inte känd. Av denna anledning hade kodningsmetoder införts för att hjälpa till att bestämma identiteten av föreningen som finns i en utvald pärla. Kodande molekyler kopplas till pärlorna parallellt med kopplingen av BBs. Strukturen för den kodande molekylen måste vara lättare att bestämma än den för biblioteksmedlemmen på kulan. Ohlmeyer et al. publicerade en binär kodningsmetod. De använde blandningar av 18 taggningsmolekyler som efter att ha klyvt dem från pärlorna kunde identifieras med Electron Capture Gas Chromatography. Nikolajev et al. tillämpade peptidsekvenser för kodning av Sarkar et al. beskrev kirala oligomerer av pentenamider (COPA) som kan användas för att konstruera masskodade OBOC-bibliotek. Kerr et al. introducerade en innovativ typ av kodning. En ortogonalt skyddad borttagbar bifunktionell linker fästes till pärlorna. Ena änden av linkern användes för att fästa de icke-naturliga BB:erna i biblioteket, medan de kodande aminosyratripletterna länkades till den andra änden. En av de tidigaste och mycket framgångsrika kodningsmetoderna introducerades av Brenner och Lerner 1992. De föreslog att man skulle fästa DNA-oligomerer till pärlorna för att koda deras innehåll. Metoden implementerades av Nielsen, Brenner och Janda med användning av den bifunktionella länken av Kerr et al. för att fästa de kodande DNA-oligomererna. Detta gjorde det möjligt att klyva ner föreningen med den DNA-kodande oligomeren fäst vid den.
Split och poolsyntes i lösning
Han et al. beskrev en metod som gjorde det möjligt att behålla fördelarna med både den höga effektiviteten av S&P-syntes och den hos ett homogent medium i de kemiska reaktionerna. I deras metod användes polyetylenglykol (PEG) som lösligt stöd i S&P-syntes av peptidbibliotek.
MeO-CH2 - CH2 - O-(CH2 - CH2 - O)n-CH2 - CH2 - OH
PEG visade sig vara lämplig för detta ändamål eftersom den är löslig i en mängd olika vattenhaltiga och organiska lösningsmedel och dess löslighet ger homogena reaktionsbetingelser även när den bundna molekylen själv är olöslig i reaktionsmediet. Separation från lösningen av polymeren och de syntetiserade föreningarna bundna till den kan uppnås genom utfällning och filtrering. Utfällningen kräver koncentrering av reaktionslösningarna och sedan spädning med dietyleter eller tert-butylmetyleter. Under noggrant kontrollerade utfällningsbetingelser fälls polymeren med de bundna produkterna ut i kristallin form och de oönskade reagensen förblir i lösning. I den fasta fasen, S&P-syntes bildas en enda förening på varje pärla, och som en konsekvens kan antalet föreningar inte överstiga antalet pärlor. Så det teoretiska maximala antalet föreningar beror på mängden av det fasta underlaget och storleken på pärlorna. På till exempel 1 g polystyrenharts kan maximalt 2 miljoner föreningar syntetiseras om hartspärlornas diameter är 90 µm, och 2 miljarder kan göras om pärlstorleken är 10 µm. I praktiken används det fasta underlaget i överskott (ofta tiofaldigt) för att vara säker på att alla förväntade komponenter bildas. Ovanstående begränsning avlägsnas fullständigt om det fasta underlaget utelämnas och syntesen utförs i lösning. I det här fallet finns det ingen övre gräns för antalet komponenter i biblioteket. Både antalet komponenter och mängden av biblioteket kan bestämmas fritt endast utifrån praktiska överväganden. En viktig modifiering infördes i syntesen av DNA-kodade kombinatoriska bibliotek av Harbury och Halpin. Det fasta underlaget i deras fall ersätts av de kodande DNA-oligomererna. Detta gör det möjligt att syntetisera bibliotek som innehåller till och med biljoner komponenter och screena dem med användning av affinitetsbindningsmetoder. Ett annat sätt att utföra S&P-syntes i lösningsfas är att applicera rensningshartser för att avlägsna biprodukterna. Scavengerhartser är polymerer med funktionella grupper som gör det möjligt att reagera med och binda komponenter i överskottet av reagenser och sedan filtrera bort dem från reaktionsblandningen Två exempel: ett harts som innehåller primära aminogrupper kan avlägsna överskottet av acylklorider från reaktionsblandningar samtidigt som ett acylkloridharts tar bort aminer. En fluorteknologi beskrevs av Curran. Fluorsyntesen använder funktionaliserade perfluoralkyl (Rf) grupper som 4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,9-Tridekafluoronyl {CF 3 (CF 2 ) 4 CF 2 CH 2 CH 2 -} grupp fäst till substrat eller reagens. Rf-grupperna gör det möjligt att avlägsna antingen produkten eller reagensen från reaktionsblandningen. I slutet av proceduren kan Rf-grupperna fästa vid substratet avlägsnas från produkten. Genom att fästa Rf-grupper till substratet kan syntesen utföras i lösning och produkten kan separeras från reaktionsblandningen genom vätskeextraktion med användning av ett fluorhaltigt lösningsmedel såsom perfluormetylcyklohexan eller perfluorhexan. Det kan ses att funktionen hos Rf-grupperna i syntesen liknar den för den fasta eller lösliga bäraren. Om Rf-etiketten är fäst vid reagenset kan dess överskott avlägsnas från reaktionsblandningen genom extraktion. Polymerstödda reagenser används också i S&P-syntes.
Särskilda egenskaper i syntesen av DNA-kodade kombinatoriska bibliotek
Självmonterande DNA-kodade bibliotek
Ett av de bästa exemplen på de speciella egenskaper som orsakas av DNA-kodning är syntesen av det självmonterande biblioteket introducerat av Mlecco et al. Först syntetiseras två underbibliotek. I ett av underbiblioteken är BB fästa vid 5'-änden av en oligonukleotid innehållande en dimeriseringsdomän följt av koderna för BB. I det andra underbiblioteket är BB:erna fästa vid 3'-änden av oligonukleotiderna som också innehåller en dimeriseringsdomän och koderna för en annan uppsättning av BB:er. De två underbiblioteken blandas i ekvimolära kvantiteter, upphettas till 70 °C och får sedan svalna till rumstemperatur, heterodimeriseras och bildar det självmonterande kombinatoriska biblioteket. En medlem av ett sådant två farmakoforbibliotek visas i figuren. Vid affinitetsscreening kan farmakoforens två BB:s interagera med målproteinets två intilliggande bindningsställen.
DNA-mallade bibliotek
Vid syntesen av DNA-mallade kombinatoriska bibliotek utnyttjas förmågan hos DNA-dubbelhelixen att styra regionspecifika kemiska reaktioner av Gartner et al. De DNA-kopplade reagenserna hålls i omedelbar närhet. Detta motsvarar den virtuella ökningen av lokal koncentration som är nästan konstant inom ett avstånd av 30 nukleotider. Närhetseffekten hjälper reaktionerna att fortsätta. Två bibliotek syntetiseras. Ett mallbibliotek som i ena änden innehåller en av BB:erna och dess kod följt av två annealingsregioner för koderna för BB:erna för de två reagensbiblioteken. Vart och ett av de två reagensbiblioteken innehåller en kodande oligonukleotid kopplad med klyvbara bindningar till reagenset (BB) som kan bilda en bindning med den redan kopplade BB med fördel av närhetseffekten. Syntesen realiseras i två steg som visas i figuren. Varje steg har tre operationer: blandning, glödgning, koppling-klyvning.
Syntes i Yoctoreactor
Yoctoreactor-metoden introducerad av Hansen et al. är baserad på geometrin och stabiliteten hos en tredimensionell DNA-struktur som skapar en kemisk reaktor av storleken yoktoliter (10 −24 L) i vilken närhet till BB:er orsakar reaktioner mellan dem. DNA-oligomererna omfattar DNA-streckkoden för de fästa BB och bildar de strukturella elementen i reaktorn. Ett slags yoctoreactor-format visas i figuren.
Sekvenskodad routing
Harbury och Halpin utvecklade DNA-mallbibliotek som styr liknande gener syntesen av DNA-kodade organiska bibliotek. Medlemmarna i det kombinatoriska mallbiblioteket innehåller koderna för alla BB:er och deras kopplingsordning. Figuren visar en medlem av ett enkelt ssDNA-mallbibliotek (A) som innehåller koderna för tre BB:er (2, 4, 6) som planerades att anslutas successivt. De kodande regionerna är åtskilda av samma icke-kodande regioner (1, 3, 5, 7) i alla medlemmar. Den sekvensstyrda proceduren använder en serie kolumner av hartspärlor som var och en är belagd med antikodonet från en av BBs (B). När mallbiblioteket överförs till en antikodonkolonn infångas den korrekta mallmedlemmen genom hybridisering och kopplas sedan med lämplig BB. Efter att ha avslutats med alla antikodonkolonner i en kopplingsposition (CP) elueras biblioteken från pärlorna i de blandade antikodonkolonnerna och de nämnda operationerna upprepas med serien av antikodonkolonner i nästa CP. I figuren visar C en medlem av mallbiblioteket fångad av det "gula" andra CP-antikodonbiblioteket. Mallen innehåller den "röda" BB som redan är kopplad i CP1 och den "gula" BB som är fäst efter dess fångst. Det slutliga biblioteket innehåller alla de syntetiserade organiska föreningarna fästa vid deras kodande DNA-oligomerer.
Stegvis koppling och kodning
En av de mest framåtblickande metoderna som vanligtvis används för DNA-kodning tillämpas vid syntes av enkelfarmakoforbibliotek. Som figuren visar är biblioteket byggt och upprepar de vanliga cyklerna för S&P-syntes. Den andra operationen av cykeln modifieras: förutom koppling med BB:erna förlängs den kodande DNA-oligomeren genom att fästa BB-koden genom ligering.
Syntes med hjälp av makroskopiska enheter av fast stöd
Modifieringar hade utvecklats som gjorde det möjligt för split- och poolsyntesen att producera kända föreningar i större mängder än innehållet i en pärla av fast bärare och bibehålla den höga effektiviteten hos den ursprungliga metoden. Såsom publicerat av Moran et al. och Nicolau et al. det harts som normalt användes i fastfassyntesen inneslutes i permeabla kapslar inkluderande en radiofrekvensetikett som registrerade BBs i ordningsföljd av deras koppling. Både manuell och automatisk maskin konstruerades för att sortera kapslarna i lämpliga reaktionskärl. En annan typ av märkt makroskopisk solid stödenhet introducerades av Xiao et al. Stöderna är 1x1 cm polystyrenympade fyrkantiga plattor. Mediet som bär koden är en 3x3 mm keramisk platta i centrum av syntesstödet. Koden etsas in i det keramiska stödet av en CO 2 -laser i form av en tvådimensionell streckkod som kan läsas av en speciell skanner.
Strängsyntes
Strängsyntesen introducerad av Furka et al. använder strängade makroskopiska solida stödenheter (kronor) och enheterna identifieras av deras position upptagen på strängen. En sträng tilldelas för varje byggblock i syntesen. I kopplingssteget är strängen i rätt reaktionskärl. Innehållet i strängarna som kommer ut från ett syntetiskt steg måste omfördelas till strängarna i nästa steg. Enheterna är inte sammanslagna. Omfördelningen som visas i figuren följer den kombinatoriska distributionsregeln: alla produkter som bildas i ett syntetiskt steg delas lika mellan alla reaktionskärl i nästa syntessteg. Olika distributionsformat kan följas som gör det möjligt att identifiera innehållet i varje krona beroende på positionen på den nya strängen och destinationsreaktionskärlet för strängen.
De strängade kronorna och brickorna som används vid manuell sortering visas i figuren. Destinationsfacket flyttas steg för steg i pilens riktning. Kronorna överförs i grupper från skårorna i källfacket till alla motsatta fack i destinationsfacket. Överföringarna styrs av dator och produkterna identifieras av placeringarna av kronorna på de sista strängarna. En snabb automatisk sorteringsmaskin hade också beskrivits. Sorteraren är skisserad i figuren. Den har två uppsättningar inriktade rör. De nedre rör sig steg för steg i den riktning som pilen visar och de myntliknande enheterna tappas från de övre källrören till de nedre destinationsrören. Rören kan också tjäna som reaktionskärl. En programvara hade också utvecklats som kan styra sortering om inte ett fullständigt kombinatoriskt bibliotek syntetiseras, bara en uppsättning av dess komponenter förbereds som plockas ut från hela biblioteket.