Skillnad gelelektrofores
Difference gelelektrofores ( DIGE ) är en form av gelelektrofores där upp till tre olika proteinprover kan märkas med storleksanpassade, laddningsmatchade spektralt upplösbara fluorescerande färgämnen (till exempel Cy3, Cy5, Cy2) före tvådimensionell gelelektrofores .
Procedur
De tre proverna blandas och laddas på IEF (isolektrisk fokuseringskromatografi) för första dimension och remsan överförs till en SDS PAGE. Efter gelelektroforesen skannas gelén med excitationsvåglängden för varje färg efter varandra, så varje prov kan ses separat (om vi skannar gelén vid excitationsvåglängden för Cy3-färgämnet, kommer vi bara att se i gelén provet som var märkt med det färgämnet). Denna teknik används för att se förändringar i proteinöverflöd (till exempel mellan ett prov av en frisk person och ett urval av en person med sjukdom), posttranslationella modifieringar, trunkationer och alla modifieringar som kan ändra storleken eller isoelektriska punkten på proteiner . De binära skiftningarna kan vara från vänster till höger (ändring i isoelektrisk punkt), vertikal (ändring i storlek) eller diagonal (ändring i både storlek och isoelektrisk punkt). Ömsesidig märkning görs för att se till att förändringarna inte beror på färgämnesberoende interaktioner.
Fördelar
Det övervinner begränsningar i traditionell 2D-elektrofores som beror på intergelvariation. Detta kan vara avsevärt även med identiska prover. Eftersom proteinerna från de olika provtyperna (t.ex. friska/sjuka, virulenta/icke-virulenta) körs på samma gel kan de direkt jämföras. För att göra detta med traditionell 2D-elektrofores krävs ett stort antal tidskrävande upprepningar.
Standarder
I experiment som omfattar flera geler är en vanlig teknik att inkludera en intern standard i varje gel. Den interna standarden framställs genom att blanda ihop flera eller alla proverna i experimentet. Detta möjliggör mätning av mängden av ett protein i varje prov i förhållande till den interna standarden. Eftersom mängderna av varje protein i den interna standarden är känd för att vara desamma i varje gel, minskar denna metod inter-gel variation.
