Ribotypning
Ribotypning är en molekylär teknik för bakteriell identifiering och karakterisering som använder information från rRNA-baserade fylogenetiska analyser. Det är en snabb och specifik metod som ofta används i klinisk diagnostik och analys av mikrobiella samhällen i mat, vatten och drycker.
Alla bakterier har ribosomala gener , men den exakta sekvensen är unik för varje art och fungerar som ett genetiskt fingeravtryck. Därför skulle sekvensering av den speciella 16S-genen och jämföra den med en databas ge identifiering av den speciella arten.
Metod
Ribotypning involverar nedbrytning av bakteriellt genomiskt DNA med specifika restriktionsenzymer . Varje restriktionsenzym skär DNA vid en specifik nukleotidsekvens, vilket resulterar i fragment av olika längder.
Dessa fragment körs sedan på en gelelektrofores , där de separeras efter storlek: appliceringen av elektriskt fält på gelén där de är suspenderade orsakar förflyttning av DNA-fragment (alla negativt laddade på grund av närvaron av fosfatgrupper) genom en matris mot den positivt laddade änden av fältet. Små fragment rör sig lättare och snabbare genom matrisen och når ett större avstånd från startpositionen än större fragment.
Efter separationen i gelmatrisen flyttas DNA-fragmenten till nylonmembran och hybridiseras med en märkt 16S eller 23S rRNA-sond. På detta sätt visualiseras endast de fragment som kodar för sådant rRNA och kan analyseras. Mönstret digitaliseras sedan och används för att identifiera ursprunget till DNA:t genom en jämförelse med referensorganismer i en databas.
Konceptuellt liknar ribotypning att sondera restriktionsfragment av kromosomalt DNA med klonade prober (slumpmässigt klonade prober eller prober härledda från en specifik kodande sekvens såsom den för en virulensfaktor ).
Se även