Reducerad representation av bisulfitsekvensering

Reduced representation bisulfite sequencing ( RRBS ) är en effektiv teknik med hög genomströmning för att analysera genomomfattande metyleringsprofiler på en enstaka nukleotidnivå. Den kombinerar restriktionsenzymer och bisulfitsekvensering för att berika områden i genomet med högt CpG -innehåll. På grund av den höga kostnaden och djupet för sekvensering för att analysera metyleringsstatus i hela genomet, Meissner et al. utvecklade denna teknik 2005 för att minska mängden nukleotider som krävs för att sekvensera till 1 % av genomet. Fragmenten som innefattar det reducerade genomet inkluderar fortfarande majoriteten av promotorer , såväl som regioner såsom upprepade sekvenser som är svåra att profilera med användning av konventionella bisulfitsekvenseringsmetoder.

En översikt över protokollet för reducerad representation av bisulfitsekvensering

Översikt över protokoll

1. Enzymdigestion: Först spjälkas genomiskt DNA med ett metyleringsokänsligt restriktionsenzym. Det är väsentligt att enzymerna inte påverkas av metyleringsstatusen för CpGs (ställen i genomet där ett cytosin finns bredvid ett guanin ) eftersom detta möjliggör nedbrytning av både metylerade och ometylerade områden. MspI används ofta. Detta enzym riktar sig mot 5'CCGG3'-sekvenser och klyver fosfodiesterbindningarna uppströms om CpG-dinukleotiden. När man använder detta specifika enzym har varje fragment en CpG i varje ände. Denna nedbrytning resulterar i DNA-fragment av olika storlekar.
2. Endreparation och A-tailing: På grund av hur MspI klyver dubbelsträngat DNA, resulterar denna reaktion i strängar med klibbiga ändar . Ändreparation är nödvändig för att fylla i 3'-terminalen på ändarna av trådarna. Nästa steg är att lägga till ett extra adenosin till både plus- och minussträngarna . Detta kallas A-Tailing och är nödvändigt för adapterligering i det efterföljande steget. Endreparation och A-Tailing görs inom samma reaktioner, med dCTP, dGTP och dATP deoxiribonukleotider. För att öka effektiviteten av A tailing tillsätts dATP i överskott i denna reaktion.
3. Sekvensadaptrar: Metylerade sekvensadaptrar ligeras till DNA-fragmenten. De metylerade adaptoroligonukleotiderna har alla cytosiner ersatta med 5'-metylcytosiner för att förhindra deaminering av dessa cytosiner i bisulfitomvandlingsreaktionen. För att sekvensera reaktioner med Illumina-sekvenserare hybridiserar sekvensadaptrar till adaptrarna på flödescellen.
4. Fragmentrening: Den önskade storleken på fragmenten väljs för rening. Olika storlekar av fragmenten separeras med hjälp av gelelektrofores och renas med hjälp av gelutskärning. Enligt Gu et al. är DNA-fragment på 40-220 baspar representativa för majoriteten av promotorsekvenser och CpG-öar
5. Bisulfitomvandling: DNA-fragmenten omvandlas sedan till bisulfit, vilket är en process som deaminerar ometylerat cytosin till en uracil . De metylerade cytosinerna förblir oförändrade på grund av att metylgruppen skyddar dem från reaktionen.
6. PCR-amplifiering: Det bisulfitkonverterade DNA:t amplifieras sedan med PCR med primrar som är komplementära till sekvensadaptrarna.
7. PCR-rening: Före sekvensering måste PCR-produkten vara fri från oanvända reaktionsreagenser som oinkorporerade dNTP eller salter. Således krävs ett steg för PCR-rening. Detta kan göras genom att köra en annan elektroforesgel eller genom att använda kit designade specifikt för PCR-rening.
8. Sekvensering: Fragmenten sekvenseras sedan. När RRBS först utvecklades användes Sanger-sekvensering initialt. Nu används nästa generations sekvenseringsmetoder. För Illumina-sekvensering utförs oftast 36-baser single-end sekvensering.
9. Sekvensjustering och analys: På grund av de unika egenskaperna hos RRBS behövs speciell programvara för justering och analys. Att använda MspI för att smälta genomiskt DNA resulterar i fragment som alltid börjar med ett C (om cytosinet är metylerat) eller ett T (om ett cytosin inte var metylerat och omvandlades till en uracil i bisulfitomvandlingsreaktionen). Detta resulterar i en icke-slumpmässig basparkomposition. Dessutom är bassammansättningen skev på grund av de snedställda frekvenserna för C och T i proverna. Olika mjukvaror för justering och analys finns tillgängliga, såsom Maq, BS Seeker, Bismark eller BSMAP. Justering till ett referensgenom gör att programmen kan identifiera baspar inom genomet som är metylerade.

Reducerad representation Bisulfite Sequencing Protocol

Fördelar

Anrikning av CpGs

RRBS använder unikt ett specifikt restriktionsenzym för att berika för CpG. MspI-digestion, eller något restriktionsenzym som känner igen CpG och skär dem, producerar endast fragment med CG i slutet. Detta tillvägagångssätt berikar för CpG-regioner i genomet, så det kan minska mängden sekvensering som krävs samt minska kostnaderna. Denna teknik är kostnadseffektiv, särskilt när man fokuserar på vanliga CpG-regioner.

Låg provingång

Endast en låg provkoncentration, mellan 10-300 ng, krävs för korrekt dataanalys. Denna teknik kan användas när det saknas värdefullt prov. En annan positiv aspekt är att färska eller levande prover inte krävs. Formalinfixerade och paraffininbäddade insatser kan också användas.

Begränsningar

Restriktionsenzym

I de specifika protokollstegen finns det också vissa begränsningar. MspI-spjälkning täcker majoriteten, men inte alla CG-regioner i genomet. Vissa CpG:er saknas. Saknade CpG kan också förekomma eftersom detta protokoll endast är ett representativt urval av genomet. Vissa regioner har alltså lägre täckning. Andra varianter av detta protokoll använder alternativa enzymer.

PCR

Under PCR-delen av protokollet måste ett icke-korrekturläsande polymeras användas eftersom ett korrekturläsande enzym skulle stanna vid uracilrester som finns i ssDNA-mallen. Att använda ett polymeras som inte korrekturläser kan också leda till ökade PCR-sekvenseringsfel.

Bisulfitsekvensering

Bisulfitsekvensering omvandlar endast enkelsträngat DNA (ssDNA). Fullständig bisulfitomvandling kräver noggrann denaturering och frånvaro av åter-annealed dubbelsträngat DNA (dsDNA). Enkla protokollsteg har visat sig driva fullständig denaturering. Att säkerställa användningen av små fragment via skjuvning eller nedbrytning, färska reagens och tillräcklig denatureringstid är avgörande för fullständig denaturering. En annan föreslagen teknik är att utföra bisulfitreaktionen vid 95 °C även om DNA-nedbrytning också sker vid höga temperaturer. Under den första timmen av bisulfitreaktionen förutsägs det att mindre än 90 % av provets DNA går förlorad genom nedbrytning. En balans mellan hög temperatur och låg temperatur krävs för att säkerställa fullständig denaturering och minskad DNA-nedbrytning. Användning av reagens, såsom urea, som förhindrar att dsDNA bildas kan också användas. Med kontaminering av dsDNA kan det vara svårt att exakt beräkna data. När ett okonverterat cytosin observeras är det utmanande att skilja mellan brist på metylering och en artefakt.

Betydelse

Betydelsen av denna teknik är att den möjliggör sekvensering av metylerade områden som inte kan profileras korrekt med hjälp av konventionella bisulfitsekvenseringstekniker. Nuvarande sekvenseringsteknologier är begränsade när det gäller profilering av områden med upprepade sekvenser. Detta är olyckligt när det gäller metyleringsstudier, eftersom dessa upprepade sekvenser ofta innehåller metylerade cytosiner. Detta är särskilt begränsande för studier som involverar profilering av cancergenom , eftersom en förlust av metylering i dessa upprepade sekvenser observeras i många cancertyper. RRBS eliminerar problemen som uppstår på grund av dessa stora områden med upprepade sekvenser och låter sålunda dessa regioner kommenteras mer fullständigt.

Ansökningar

Metylomer i cancergenomik

Avvikande metylering har observerats vid cancer. Vid cancer har såväl hypermetylering som hypometylering setts i tumörer. Eftersom RRBS är mycket känsligt kan denna teknik användas för att snabbt titta på avvikande metylering vid cancer. Om prover från patientens tumör och normala celler kan erhållas kan en jämförelse mellan dessa två celltyper observeras. En profil av den totala metyleringen kan produceras ganska snabbt. Denna teknik kan snabbt bestämma den övergripande metyleringsstatusen för cancergenom, vilket är kostnads- och tidseffektivt.

Metyleringstillstånd under utveckling

Stegspecifika förändringar kan observeras i alla levande organismer. Modifieringar i övergripande metyleringsnivåer via reducerad representationsbisulfitsekvensering kan vara användbara i utvecklingsbiologi.

Jämförelse med andra tekniker

Resultat som jämförs mellan RRBS och MethylC-seq är mycket överensstämmande med varandra. Naturligtvis har MethylC-seq en större genomomfattande täckning av CpG jämfört med RRBS, men RRBS har en större täckning på CpG-öar. En av de andra mest använda teknikerna för profilering av metylering är MeDiP-Seq. Denna teknik görs genom immunoutfällning av metylerade cytosiner och efterföljande sekvensering. RRBS har en högre upplösning jämfört med denna teknik, eftersom MeDip-Seq är begränsad till 150 baspar jämfört med en nukleotidupplösning för RRBS. Bisulfitmetoder, såsom de används av RRBS, visade sig också vara mer exakta än anrikningsbaserade, såsom MeDip-Seq. Data som erhållits om RRBS och Illumina Infinium-metylering är mycket jämförbara, med en Pearson-korrelation på 0,92. Data för båda plattformarna är också direkt jämförbara eftersom båda använder en absolut mätning av DNA.

Slutligen utvecklades Anchor-Based Bisulfite Sequencing (ABBS) av Ben Delattes grupp på Active Motif. Denna teknik använder specialiserade primers som fångar DNA-metylering vilket möjliggör ökad täckning (ca 10 gånger mer än WGBS) och sänker sekvenseringskostnaderna. De visade också att ABBS inte är lika begränsad som RRBS och kan användas som ett alternativ för MeDIP-seq med bibehållen basupplösning.