Produktion av reaktiva syrearter i marina mikroalger
Alla levande celler producerar reaktiva syrearter (ROS) som en biprodukt av metabolism. ROS är reducerade syreintermediärer som inkluderar superoxidradikalen ( O 2 − ) och hydroxylradikalen (OH•), såväl som den icke-radikala arten väteperoxid (H 2 O 2 ). Dessa ROS är viktiga för cellers normala funktion och spelar en roll i signaltransduktion och uttrycket av transkriptionsfaktorer. Men när det finns i överskott kan ROS orsaka skador på proteiner, lipider och DNA genom att reagera med dessa biomolekyler för att modifiera eller förstöra deras avsedda funktion. Som ett exempel har förekomsten av ROS kopplats till åldrandeprocessen hos människor, såväl som flera andra sjukdomar inklusive Alzheimers , reumatoid artrit , Parkinsons och vissa cancerformer. Deras potential för skada gör också reaktiva syrearter användbara i direkt skydd mot invaderande patogener, som ett försvarssvar på fysisk skada och som en mekanism för att stoppa spridningen av bakterier och virus genom att inducera programmerad celldöd .
Reaktiva syrearter finns i låga koncentrationer i havsvatten och produceras främst genom fotolys av organiskt och oorganiskt material. Den biologiska produktionen av ROS, som genereras genom algfotosyntes och som därefter "läcker ut" till miljön, kan dock bidra väsentligt till koncentrationerna i vattenpelaren. Även om det finns mycket lite information om den biologiska genereringen av ROS i marina ytvatten, har flera arter av marint växtplankton nyligen visat sig släppa ut betydande mängder ROS i miljön. Denna ROS har potential att skada närliggande organismer, och har faktiskt varit inblandad som orsaken till massiv fisk, bakterier och protistdödlighet.
Kemisk bakgrund
I havsvatten kan ROS genereras genom såväl abiotiska som biotiska processer, bland annat radiolys och fotolys av vattenmolekyler och cellandning. Enligt en modell som Fan föreslagit för förutsägelse av ROS i ytvatten kan biokemin som förmedlas av växtplankton vara lika viktig för produktionen av ROS som fotokemi. Biologisk ROS syntetiseras ofta i mitokondriella membran, såväl som det endoplasmatiska retikulumet hos djur, växter och vissa bakterier. Dessutom är kloroplaster och organellerna peroxisomer och glyoxysomer också platser för generering av ROS. De ROS som mest sannolikt släpps ut i miljön är de som produceras vid cellytan när elektroner "läcker" från andningskedjan och reagerar med molekylärt syre, O 2 . Produkterna av denna efterföljande reduktion av molekylärt syre är vad som kallas reaktiva syrearter. Produktionen av ROS står således i direkt proportion till koncentrationen av O 2 i systemet, med ökningar av O 2 som leder till högre produktion av ROS. Det finns tre huvudsakliga reaktiva syrearter: superoxidanjonen (O 2 − ), väteperoxid (H 2 O 2 ) och hydroxylradikalen (OH•). Superoxidanjonen bildas direkt från en-elektronreduktionen av molekylärt syre. Väteperoxid bildas sedan från disproportioneringen av superoxidanjonen. Denna reaktion sker mycket snabbt i havsvatten. Därefter ger reduktionen av väteperoxid hydroxylradikalen, H 2 O 2 ↔2OH•, som sedan kan reduceras till hydroxyljonen och vatten. Förekomsten av reaktiva syrearter i marina system är dock svår att upptäcka och mäta exakt, av ett antal anledningar. För det första är ROS-koncentrationerna generellt låga (nanomoler) i havsvatten. För det andra kan de reagera med andra svåridentifierade molekyler som förekommer i låga mängder, vilket resulterar i okända produkter. Slutligen är de (för det mesta) transienta mellanprodukter, med livstider så korta som mikrosekunder.
Superoxidproduktion
Enligt Blough & Zepp är superoxid en av de svåraste reaktiva syrearterna att kvantifiera eftersom den finns i låga koncentrationer: 2×10 −12 M i det öppna havet och upp till 2×10 −10 M i kustområden. De huvudsakliga källorna till biologisk superoxid i havet kommer från minskningen av syre vid cellytan och metaboliter som släpps ut i vattnet. I marina system fungerar superoxid oftast som en enelektron-reduktionsmedel, men den kan också fungera som en oxidant och kan öka de normalt långsamma oxidationshastigheterna av miljöföreningar. Superoxid är mycket instabil, med mellan 50 och 80 % av dess koncentration av anjoner som spontant inte står i proportion till väteperoxid. Vid sin topp sker denna reaktion med en hastighetskonstant i storleksordningen 2,2×10 4 – 4,5×10 5 L mol −1 sek −1 i havsvatten. Dismutationen av superoxid till väteperoxid kan också katalyseras av antioxidantenzymet superoxiddismutas med en hastighetskonstant i storleksordningen 2×10 9 L mol −1 sek −1 . Som ett resultat av dessa snabbverkande processer är steady state-koncentrationen av superoxid mycket liten. Eftersom superoxid också är måttligt reaktivt mot spårmetaller och löst organiskt material, tros eventuell kvarvarande superoxid avlägsnas från vattenpelaren genom reaktioner med dessa arter. Som ett resultat har närvaron av superoxid i ytvatten varit känd för att resultera i en ökning av reducerat järn. Detta tjänar i sin tur till att öka tillgängligheten av järn till växtplankton vars tillväxt ofta begränsas av detta viktiga näringsämne. Som en laddad radikalart är det osannolikt att superoxid påverkar en organisms cellulära funktion avsevärt eftersom den inte lätt kan diffundera genom cellmembranet. Istället ligger dess potentiella toxicitet i dess förmåga att reagera med extracellulära ytproteiner eller kolhydrater för att inaktivera deras funktioner. Även om dess livslängd är ganska kort (cirka 50 mikrosekunder), har superoxid potential att nå cellytor eftersom den har ett diffusionsavstånd på cirka 320 nm.
Produktion av väteperoxid
Reduktionsprodukten av superoxid är väteperoxid, en av de mest studerade reaktiva syreämnena eftersom den förekommer i relativt höga koncentrationer, är relativt stabil och är ganska lätt att mäta. Man tror att algfotosyntes är ett av de viktigaste sätten för väteperoxidproduktion, medan produktionen av H 2 O 2 av stressade organismer är en sekundär källa. I marina system finns väteperoxid (H 2 O 2 ) i koncentrationer av 10 −8 -10 −9 M i den fotografiska zonen, men har hittats i dubbelt så hög koncentration i delar av Atlanten. Dess livslängd, från timmar till dagar i kustvatten, kan vara så lång som 15 dagar i Antarktis havsvatten. H 2 O 2 är viktigt i vattenmiljöer eftersom det kan oxidera löst organiskt material och påverka redoxkemin hos järn, koppar och mangan. Eftersom väteperoxid, som en oladdad molekyl, lätt diffunderar över biologiska membran kan den direkt skada cellulära beståndsdelar (DNA och enzymer) genom att reagera med dem och inaktivera deras funktioner. Dessutom reduceras väteperoxid till hydroxylradikalen, den mest reaktiva radikalen och den med störst risk för skada.
Hydroxylradikalproduktion
Även om superoxid- och väteperoxidradikalerna är giftiga i sig själva, blir de potentiellt mer giftiga när de interagerar och bildar hydroxylradikalen (OH•). Detta fortsätter genom den järn- och kopparkatalyserade Haber–Weiss-reaktionen : O 2 − + Fe 3+ ↔ O 2 + Fe 2+ H 2 O 2 + Fe 2+ ↔ Fe 3+ + OH• + OH −
Eftersom järn och koppar finns i kustvatten, kan hydroxylradikalen bildas genom reaktioner med någon av dessa, och i själva verket resulterar deras oxidation i betydande källor till hydroxylradikaler i havet. Hydroxylradikalen är den mest instabila av ROS (livslängd på 10 −7 sekunder), och reagerar med många oorganiska och organiska arter i den omgivande miljön med hastigheter nära diffusionsgränsen (hastighetskonstanter på 10 8 -10 10 L mol -1 sek . −1 ). I havsvatten avlägsnas radikalen som ett resultat av reaktioner med bromidjoner, medan den i sötvatten huvudsakligen reagerar med bikarbonat- och karbonatjoner. Eftersom den har en så hög reaktivitet är dagtidskoncentrationerna i ytvatten av hydroxylradikalen i allmänhet mycket låga (10 −19 till 10 −17 M). Hydroxylradikalen kan oxidera membranlipider och få nukleinsyror och proteiner att denaturera. Men eftersom radikalen är så reaktiv finns det sannolikt inte tillräckligt med tid för transport till cellytan (genomsnittligt diffusionsavstånd på 4,5 nm). Således förväntas direkta effekter på organismer av externt genererade hydroxylradikaler vara minimala. Indirekt kan hydroxylradikalen resultera i betydande biogeokemiska förändringar i marina system genom att påverka kretsloppet av löst organiskt material och spårmetaller. Både intracellulära och extracellulära reaktiva syrearter kan avlägsnas från miljön av antioxidanter som produceras biologiskt som en försvarsmekanism. Många växtplankton, till exempel, har visat sig ha många superoxidfångande (superoxiddismutas) och väteperoxidfångande enzymer (katalas, askorbatperoxidas och glutationperoxidas). Antioxidanten superoxiddismutas katalyserar bildningen av väteperoxid från superoxidanjonen genom följande reaktion: 2 O 2 − + 2H + ↔ O 2 + H 2 O 2 . På liknande sätt ökar katalas bildandet av vatten från väteperoxid genom att katalysera reaktionen: 2H 2 O 2 ↔ O 2 + 2H 2 O. Som ett resultat av denna reaktion förhindras hydroxylradikalen från att bildas. Dessutom kan förekomsten av stora mängder humics i vattnet också fungera som antioxidanter av ROS. Det måste dock noteras att vissa ROS kan inaktivera vissa enzymer. Till exempel är superoxidanjonen känd för att tillfälligt hämma funktionen av katalas vid höga koncentrationer.
Kontroller av ROS-produktion i alger
Många algarter har visat sig inte bara producera reaktiva syrearter under normala förhållanden utan även öka produktionen av dessa föreningar under stressiga situationer. I synnerhet har ROS-nivåer visat sig påverkas av cellstorlek, celldensitet, tillväxtstadium, ljusintensitet, temperatur och näringstillgänglighet.
Cellstorlek
Oda et al. fann att skillnader i produktionen av ROS berodde på cellens storlek. Genom att jämföra fyra arter av flagellater visade de att den större arten Ichatonella producerade mest superoxid och väteperoxid per cell än Heterosigma akashiwo , Olisthodiscus luteus och Fibrocapsa japonica . I en jämförelse av 37 arter av marina mikroalger, inklusive dinoflagellater, rhaphidophytes och klorofyter, Marshall et al. fann också ett direkt samband mellan cellstorlek och mängden superoxid som produceras. De största cellerna, Chattonella marina , producerade upp till 100 gånger mer superoxid än de flesta andra marina alger (se figur i ). Författarna föreslår att eftersom ROS produceras som en biprodukt av metabolism, och större celler är mer metaboliskt aktiva än mindre celler, följer det att större celler borde producera mer ROS. På samma sätt, eftersom fotosyntes också producerar ROS, har större celler sannolikt en större volym av kloroplaster och skulle förväntas producera mer ROS än mindre celler.
Algtäthet
Produktionen av ROS har också visat sig vara beroende av algcelldensitet. Marshall et al. fann att för Chattonella marina producerade högre koncentrationer av celler mindre superoxid per cell än de med lägre densitet. Detta kan förklara varför vissa rafydofytblomningar är giftiga vid låga koncentrationer och giftfria i kraftiga blomningar. Tang & Gobler fann också att celldensiteten var omvänt relaterad till ROS-produktionen för algen Cochlodinium polykrikoides . De fann dessutom att ökningar av ROS-produktion också var relaterade till tillväxtfasen av alger. Speciellt var alger i exponentiell tillväxt mer toxiska än de i den stationära eller sena exponentiella fasen. Många andra algarter ( Heterosigma akashiwo , Chattonella marina och Chattonella antiqua ) har också visat sig producera de högsta mängderna ROS under den exponentiella tillväxtfasen. Oda et al. antyder att detta beror på att aktivt växande celler har högre fotosyntes och metaboliska hastigheter. Celler i vilostadiet av Chattonella antiqua har visat sig generera mindre superoxid än deras motila motsvarigheter.
Ljusnivåer
Eftersom superoxid produceras genom autooxidation av en elektronacceptor i fotosystem I under fotosyntes, skulle man förvänta sig ett positivt samband mellan ljusnivåer och alg-ROS-produktion. Detta är verkligen vad som har visats: i kiselalgen Thallasia weissflogii orsakade en ökning av ljusintensiteten en ökning av produktionen av både superoxid och väteperoxid. På liknande sätt, i flagellaterna Chattonella marina , Prorocentrum minimum och Cochlodinium polykrikoides , resulterade minskningar i ljusnivåer i minskad superoxidproduktion, med högre nivåer producerade under dagen. Men eftersom många studier har funnit att ROS-produktionen är relativt hög även i mörker, är andra metaboliska vägar än fotosyntes sannolikt viktigare för produktionen. Till exempel, Liu et al. fann att ROS-produktionen reglerades av järnkoncentration och pH. Från dessa bevis antyder de att ROS-produktion troligen beror på ett plasmamembranenzymsystem beroende på järntillgänglighet. På liknande sätt, i Heterosigma akashiwo, resulterade utarmningen av järn och en ökning av temperaturen, inte ljusintensiteten, i ökad produktion av ROS. Liu et al. hittade samma samband med temperatur.
Funktioner av algproducerade ROS
Den aktiva frisättningen av reaktiva syrearter från celler har en mängd olika syften, inklusive ett sätt att avskräcka rovdjur, eller ett kemiskt försvar mot konkurrenters oförmåga. Dessutom kan ROS vara involverad i cellsignalering, såväl som oxidation eller reduktion av nödvändiga eller giftiga metaller.
Kemiskt försvar
Det är inte förvånande att ROS-produktion kan vara en form av kemiskt försvar mot rovdjur, eftersom det vid låga nivåer kan skada DNA och vid höga nivåer leda till cellnekros. En av de vanligaste mekanismerna för cellskador är reaktionen av ROS med lipider, vilket kan störa enzymaktivitet och ATP-produktion och leda till apoptos. Reaktioner av ROS med proteiner kan modifiera aminosyror, fragmentera peptidkedjor, förändra elektriska laddningar och slutligen inaktivera ett enzyms funktion. I DNA kan deletioner, mutationer och andra dödliga genetiska effekter vara resultatet av reaktioner med ROS. Reaktiva syrearter är särskilt billiga att producera som försvarskemikalier, helt enkelt för att de inte är sammansatta av metaboliskt kostsamma element som kol, kväve eller fosfat. Reaktiva syrearter som produceras av växtplankton har kopplats till dödsfall av fisk, skaldjur och protister, samt visat sig minska livskraften och tillväxten av bakterier. Dessutom har en studie av Marshall et al. visade att fyra algarter som användes som foder för musslor producerade betydligt lägre koncentrationer av superoxid, vilket tyder på att ROS-produktion av andra algarter kan vara ett sätt att minska musslors bete. Det mest direkta beviset för ROS som försvarsmekanism är det faktum att många iktyotoxiska alger producerar högre koncentrationer av ROS än icke-iktyotoxiska stammar.
Förbättring av giftiga exsudat
Det är möjligt att ROS kanske inte är det faktiska giftiga ämnet, men att det faktiskt kan fungera för att göra andra exsudat mer giftiga genom att oxidera dem. Till exempel har ROS från Chattonella marina visat sig förstärka de toxiska effekterna av fettsyran eikosapentaensyra (EPA) på exponerade fiskar. På liknande sätt är fria fettsyror som frigörs från kiselalgerbiofilmer som produkter av ROS-oxidation av EPA kända för att vara giftiga för djurplanktörer. Dessutom har Fontana et al. föreslog att interaktionen mellan ROS och kiselalgerexsudat (såsom fettsyrahydroperoxider) är ansvariga för att hämma embryonal utveckling och orsaka larvavvikelser hos copepoder. Slutligen har ROS-oxidation av alger fleromättade fettsyror också visat sig avskräcka betare.
Konkurrensfördel
Förutom att påverka interaktioner mellan rovdjur och bytesdjur kan produktionen av ROS också hjälpa en alg att få en fördel i konkurrensen om resurser mot andra alger, vara ett sätt att förhindra påväxt av bakterier och fungera som en signalmekanism mellan celler. ROS kan hämma fotosyntesen hos alger. En alg som är mer tolerant mot ROS än en annan kan alltså producera och frigöra den som ett sätt att minska den andra artens konkurrensförmåga. Dessutom Chattonella marina , den mest välstuderade rafydofyten för ROS-produktion, producera en gräns för ROS som avskräcker andra marina mikroalger från att använda näringsämnen i sin närhet. På liknande sätt kan denna gräns också vara ett sätt att motverka bakteriepåväxt, eftersom produktionen av ROS är känd för att hämma tillväxt och bioluminescent förmåga i bakterierna Vibrio alginolyticus respektive Vibrio fischeri . Slutligen, Marshall et al. visade att Chattonella marina- celler kunde ändra sin hastighet av superoxidproduktion på så lite som en timme när de var i olika celldensiteter, vilket ökade hastigheten från 1,4 till 7,8 gånger originalet. De föreslår att denna snabba reaktion i att ändra produktionshastigheter kan vara en form av kemisk signalering mellan celler som arbetar för att ge information om celldensitet.
Minskning av metaller
ROS kan vara användbart vid oxidation eller reduktion av nödvändiga eller giftiga metaller. Eftersom järn är nödvändigt för växtplanktontillväxt kan autoreduktionen av reaktiva syrearter vara ett sätt för alger att få användbart järn från fritt eller organiskt bundet järn. Till exempel, Cakman et al. visade att ROS kan öka mängden tillgängligt järn genom extracellulär järnreduktion. Man tror att den höga reducerande kraften hos denna reaktion bibehålls genom den elektronrika superoxidjonen. I flera studier på ROS-produktionen av Heterosigma akashiwo visade sig väteperoxidproduktionen vara omvänt proportionell mot koncentrationen av tillgängligt järn. Dessutom fann Cornish och Page 1998 att växtplankton producerar mer ROS när det finns lägre nivåer av extracellulärt järn. De föreslog att när intracellulärt järn är begränsande svarar växtplanktonet genom att producera mer ROS som ett sätt att öka den reducerande potentialen runt cellen och därmed bättre kunna reducera det järnet till en användbar form. På liknande sätt skulle lägre ROS-produktion tyda på att det intracellulära järnet har tillräckligt höga nivåer för cellulär funktion.