MIQE

Minimiinformationen för publicering av kvantitativa realtids-PCR-experiment ( MIQE ) -riktlinjer är en uppsättning protokoll för att genomföra och rapportera kvantitativa realtids-PCR- experiment och data, som utarbetats av Bustin et al. 2009. De utarbetades efter att en artikel publicerades 2002 som hävdade att de upptäcker mässlingsvirus hos barn med autism genom användning av RT-qPCR, men resultaten visade sig vara helt omöjliga att reproducera av andra forskare. Författarna själva försökte inte heller reproducera dem och rådata visade sig ha en stor mängd fel och grundläggande fel i analysen. Denna incident fick Stephen Bustin att skapa MIQE-riktlinjerna för att tillhandahålla en baslinjekvalitet för qPCR-data publicerade i vetenskaplig litteratur.

Syfte

MIQE-riktlinjerna skapades på grund av den låga kvaliteten på qPCR-data som skickades till akademiska tidskrifter vid den tiden, vilket bara blev vanligare eftersom nästa generations sekvenseringsmaskiner gjorde det möjligt att köra sådana experiment till en billigare kostnad. Eftersom tekniken används inom all vetenskap inom flera områden, skiljer sig instrumenten, metoderna och designen för hur qPCR används mycket. För att hjälpa till att förbättra den övergripande kvaliteten gjordes MIQE-riktlinjerna som generaliserade förslag på grundläggande experimentella procedurer och former av data som bör samlas in som en miniminivå av rapporterad information för andra forskare att förstå och använda när de läser det publicerade materialet. Att upprätta en erkänd och i stort sett överenskommen uppsättning riktlinjer som dessa ansågs viktigt av forskarsamhället, särskilt på grund av den ständigt ökande mängden vetenskapligt arbete som kommer från utvecklingsländer med många olika språk och protokoll.

Historia

Utveckling av originalversionen

Under 2009 samarbetade en internationell grupp forskare under ledning av Stephen Bustin för att sätta ihop en uppsättning riktlinjer för hur man utför qPCR och vilka former av data som ska samlas in och publiceras i processen. Detta gjorde det också möjligt för redaktörer och recensenter av vetenskapliga tidskrifter att använda riktlinjerna när de tittade över ett insänt dokument som inkluderade qPCR-data. Således sattes riktlinjerna upp som en sorts checklista för varje steg i proceduren, där vissa punkter markerades som väsentliga (E) vid inlämnande av data för publicering och andra markerade som bara önskvärda (D).

En ytterligare version av riktlinjerna publicerades i september 2010 för användning med fluorescensbaserad kvantitativ realtids-PCR. Det fungerade också som en precis för den bredare formen av riktlinjerna. Andra forskare har skapat ytterligare versioner för specifika former av qPCR som kan kräva en kompletterande eller annan uppsättning artiklar att kontrollera, inklusive encells qPCR och digital PCR (dPCR). Lämplig efterlevnad av de befintliga MIQE-riktlinjerna har också överblickats inom andra vetenskapliga områden, inklusive fotobiomodulering och kliniska biomarkörer .

Det noterades av Bustin 2014 (och igen av honom 2017) att det fanns en viss mängd upptag och användning av MIQE-riktlinjerna inom det vetenskapliga samfundet, men det fanns fortfarande alldeles för många publicerade artiklar med qPCR-experiment som saknade ens de mest grundläggande datapresentation och korrekt bekräftelse av effektiviteten för nämnda data. Dessa studier behöll stora reproducerbarhetsproblem, där slutsatserna av deras bevis inte kunde replikeras av andra forskare, vilket kastade tvivel om de första resultaten. Allt detta var trots att många artiklar direkt citerade Bustins ursprungliga MIQE-publikation, men inte följde igenom checklistan med riktlinje med material i sina egna experiment. Vissa forskare har dock påpekat åtminstone en viss framgång, med ett antal artiklar som avvisats av akademiska tidskrifter för publicering på grund av att de inte klarade MIQE-checklistorna. Andra studier har dragits tillbaka efter det att deras brist på korrekt data för att klara MIQE-riktlinjerna noterades och offentligt påpekades för tidskriftsredaktörerna.

Skärpning av riktlinjer

När New England Biolabs satte upp sina nya jämförande qPCR-system med titeln "Dots in Boxes" 2017, uppgav New England Biolabs att de hade utformat datainsamlingsdelen kring MIQE-riktlinjerna så att data passar alla minimiparameterchecklistor i protokollen. Andra vetenskapliga instrumentföretag har hjälpt till med att följa riktlinjerna genom att målmedvetet skräddarsy sina enheter för dem, inklusive Bio-Rad som skapar en mobilapp som möjliggör aktiv markering av MIQE-checklistan när varje steg slutförs.

En översikt över 10-årsjubileet sedan publiceringen av MIQE-riktlinjerna genomfördes i juni 2020 och diskuterade de vetenskapliga studier som hade gett bättre och mer organiserade resultat när man följt riktlinjerna. I augusti 2020 publicerades en uppdaterad version av riktlinjerna för den digitala PCR-metoden för att ta hänsyn till förbättringar av maskiner, teknologier och tekniker sedan den ursprungliga utgåvan 2013. Ytterligare riktlinjesteg lades till för dataanalys, samtidigt som det gav en mer förenklad checklisttabell för forskare att använda. En RT-qPCR- inriktningsanalys utvecklades tillsammans med Stephen Bustin med hjälp av MIQE-riktlinjerna för kliniska biomarkörer i december 2020 för att identifiera den kliniska närvaron av COVID-19 -viruspartiklar under COVID-19-pandemin .

Riktlinjer översikt

MIQE-riktlinjerna är uppdelade i 9 olika avsnitt som utgör checklistan. Dessa inkluderar inte bara överväganden för att göra själva qPCR, utan också hur de resulterande data samlas in, analyseras och presenteras. En viktig del av det senare är att inkludera information om vilken analysmjukvara som används och även att skicka in rådata till relevanta databaser.

Experimentell design

Stora delar av riktlinjerna inkluderar grundläggande åtgärder som normalt skulle inkluderas i experiment och publikationer oavsett, till exempel ett objekt för att beskriva skillnaderna mellan experiment och kontrollgrupp. Annan sådan information inkluderar hur många individuella enheter som används i varje grupp i experimentet. Dessa två delar definieras som väsentliga för alla studier. Det här avsnittet innehåller också två önskvärda punkter, som pekar på om författarens laboratorium själv eller ett kärnlaboratorium vid universitetet eller organisationen genomförde qPCR-analysen och ett erkännande av alla andra individer som bidragit till arbetet.

Prov

De väsentliga kraven som prover och provmaterial ska uppfylla är bland annat en beskrivning av provet, vilken form av dissektion som användes, vilken bearbetningsmetod som gjordes, om proverna var frysta eller fixerade och hur lång tid tog det samt vilka provförhållanden som användes. . Det är också önskvärt att veta volymen eller massan av provet som bearbetades för qPCR.

Nukleinsyraextraktion

För processen att extrahera DNA/RNA finns det ett antal viktiga riktlinjer. Detta inkluderar en beskrivning av extraktionsprocessen som gjorts, ett uttalande om vilket DNA-extraktionskit som användes och eventuella ändringar som gjorts i anvisningarna, detaljer om huruvida någon DNas- eller RNase -behandling användes, ett uttalande om huruvida någon kontaminering bedömdes, en kvantifiering av mängden extraherat genetiskt material, en beskrivning av de instrument som används för extraktionen, de metoder som används för att bibehålla RNA-integritet, en uppgift om RNA-integritetsnummer och kvalitetsindikator och kvantifieringscykeln (Cq) som uppnåddes, och slutligen vilken testning som gjordes för att fastställa närvaron eller frånvaron av inhibitorer . Fyra önskade uppgifter är varifrån de använda reagensen erhölls, vilken genetisk renhetsnivå som erhölls, vilket utbyte som erhölls och en elektroforesgelbild för bekräftelse.

Omvänd transkription

De primära väsentliga delarna för denna fas inkluderar att detaljera reaktionsförhållandena i sin helhet, ange både mängden RNA som används och den totala volymen av reaktionen, ge information om oligonukleotiden som används som primer och dess koncentration, koncentrationen och typen av omvänt transkriptas användes, och slutligen temperaturen och tidsåtgången för reaktionen. Det är också önskvärt att ha katalognumren på reagenser som används och deras tillverkare, standardavvikelsen för Cq med och utan att transkriptaset är inblandat och hur cDNA:t lagrades .

qPCR-målinformation

All grundläggande information om målet är nödvändig här, inklusive gensymbolen, accessionsdatabasnumret för den aktuella sekvensen, längden på sekvensen som amplifieras, information om specificitetsskärmen som används såsom BLAST , vilka splitsningsvarianter som finns för sekvensen och var exonet eller intronet för varje primer är. Det finns flera önskade men inte nödvändiga informationsdelar för denna sektion, såsom platsen för amplikonet , om det finns några pseudogener eller homologer , huruvida en sekvensanpassning gjordes och data erhållna från den, och eventuella data om den sekundära strukturen av den amplifierade sekvensen.

qPCR-oligonukleotider

Skapandet av oligonukleotiderna kräver endast två delar av väsentlig information: de använda primersekvenserna och platsen och detaljerna för eventuella modifieringar som gjorts av sekvensen. Men det finns flera önskvärda data, inklusive identifikationsnumret från RTPrimerDB-databasen, sekvenserna från sonderna, tillverkaren som användes för att tillverka oligos och hur de renades.

qPCR-protokoll

Som ett av de primära segmenten i riktlinjerna finns det flera viktiga delar på checklistan för själva qPCR-processen. Detta inkluderar hela uppsättningen av villkor som används för reaktionen, volymen av både reaktionen och cDNA, koncentrationerna för sonderna, magnesiumjoner och dNTP , vilken typ av polymeras som användes och dess koncentration, vilket kit som användes och dess tillverkare, vilka tillsatser till reaktionen som användes, vem som tillverkade qPCR-maskinen och vilka parametrar som ställdes in för termocyklingsprocessen . Den enda ytterligare önskade informationen är den kemiska sammansättningen av bufferten som används, vem som tillverkade de använda plattorna och rören och vad deras katalognummer är, och om reaktionen ställdes in manuellt eller med en maskin.

qPCR-validering

För att bekräfta effektiviteten och kvaliteten på qPCR-processen som utfördes, finns det flera åtgärder och efterföljande data som måste presenteras. Detta inkluderar att förklara den specifika metoden för att kontrollera att processen fungerade, som att använda en gel, direkt sekvensering av det genetiska materialet, visa en smältprofil eller från digestion med restriktionsenzym . Om SYBR Green I användes, måste Cq för kontrollgruppen utan mall-DNA anges. Ytterligare väsentliga data inkluderar kalibreringen av maskinkurvorna med lutningen och y-avskärningen noterad, effektiviteten av PCR-processen som bestäms från den tidigare nämnda lutningen, korrelationskoefficienterna (r i kvadrat) för kalibreringskurvorna, det dynamiska området för de linjära kurvorna , Cq som hittades vid den lägsta koncentrationen där 95 % av resultaten fortfarande var positiva ( LOD ) tillsammans med bevisen för själva LOD, och slutligen om en multiplex används, måste effektiviteten och LOD anges för varje analys som görs.

Den extra önskade informationen inkluderar bevis givet att qPCR-optimering inträffade genom användning av gradienter, konfidensintervallen för att visa effektiviteten hos qPCR och konfidensintervallen för hela det testade området.

Dataanalys

Det sista avsnittet av riktlinjerna innehåller information om hur analysen av qPCR-data gjordes. De väsentliga delarna av det inkluderar programmet och programversionen som användes för analysen, metoden för hur Cq bestämdes, att ta reda på extrempunkterna i data och hur de används eller exkluderas och varför, vilka resultat hittades för kontrollerna utan templat genetiskt material, en förklaring till varför referensgenerna som användes valdes och varför antalet av dem valdes, metoden som användes för att normalisera data, hur många tekniska replikat som inkluderades, hur repeterbara var data i analyserna, vad metoder användes för att bestämma betydelsen av resultaten och vilken programvara som användes för denna del av den kvalitativa analysen.

Det är också önskvärt att inkludera information om antalet biologiska replikat och om de stämmer överens med resultaten från de tekniska replikaten, reproducerbarhetsdata för koncentrationsvarianterna, data om effektanalysen och slutligen för forskarna att lämna in rådata i RDML-filformat.

Vidare läsning

•   Shipley, Greg (2011). "MIQE-riktlinjerna oskyddade". I Kennedy, Suzanne; Oswald, Nick (red.). PCR-felsökning och optimering: Den grundläggande guiden . Horizon Scientific Press . s. 151–166. ISBN 978-1904455721 .