MARCM
Mosaikanalys med en repressibel cellmarkör, eller MARCM , är en genetisk teknik för att skapa individuellt märkta homozygota celler i en annars heterozygot Drosophila melanogaster . Det har varit ett avgörande verktyg för att studera utvecklingen av nervsystemet Drosophila . Denna teknik bygger på rekombination under mitos medierad av FLP-FRT-rekombination . Eftersom en kopia av en gen, tillhandahållen av balanskromosomen , ofta räcker för att rädda en mutant fenotyp , kan MARCM-kloner användas för att studera en mutant fenotyp i ett annars vildtypsdjur .
Går över
.gif)
För att märka små populationer av celler från en gemensam stamfader använder MARCM systemet GAL4-UAS . En markörgen såsom GFP placeras under kontroll av en UAS- promotor . GAL4 uttrycks överallt i dessa flugor, vilket driver marköruttrycket. Dessutom drivs GAL80 av en stark promotor som tubP. Gal80 är en hämmare av GAL4 och kommer att undertrycka GFP-uttryck under normala förhållanden. Detta tubP-GAL80-element placeras distalt om ett FRT-ställe. Ett andra FRT-ställe placeras i trans till GAL80-stället, vanligtvis med en gen eller mutation av intresse distalt därtill. Slutligen drivs FLP-rekombinas av en inducerbar promotor såsom värmechock.
När FLP-transkription induceras, kommer den att rekombinera kromosomerna vid de två FRT-ställena i celler som genomgår mitos. Dessa celler kommer att delas i två homozygota dotterceller - en som bär båda GAL80-elementen och en som inte bär några. Dottercellen som saknar GAL80 kommer att märkas på grund av uttryck av markören via GAL4-UAS-systemet. Alla efterföljande dotterceller från denna stamfader kommer också att uttrycka markören.
Labs kommer ofta att ha MARCM-färdiga linjer som har den inducerbara FLP, GAL80 distalt till en FRT-plats, GAL4 och UAS-markör. Dessa kan lätt korsas med flugor som har en mutation av intresse distalt till en FRT-plats.
Används
Genom att dra fördel av MARCM kan man enkelt spåra alla celler som har genererats från en enda stamfader. Detta är ett användbart verktyg för att spåra utveckling och specifika cellinjer i olika miljöförhållanden. Tillämpningar för MARCM inkluderar studier av neuronala kretsar , klonal analys, genetisk screening , spermatogenes , tillväxtkonutveckling , neurogenes och tumörmetastaser .
Många framsteg i förståelsen av Drosophila utveckling har uppnåtts genom MARCM. Utvecklingen, linjerna och karakteriseringarna av sekundära axonkanaler, anatomiska kartor över kolinerga neuroner i de visuella systemen, linjer som ger upphov till en thorax hemineuromer-ställning och utvecklingsramverket för CNS-arkitektur, Deltas roll i utvecklingsprogrammering i den ventrala nervsträngen , de vaken-främjande oktopaminerga cellerna i det mediala protocerebrum , gener involverade i neuronal morfogenes av svampkropparna och regleringen av commissural axon-vägledning har alla identifierats genom MARCM-tekniker.
Variationer
Det finns många varianter av MARCM. Twin-spot MARCM möjliggör märkning av systerkloner med två separata markörer, vilket möjliggör en högre upplösning av härstamningsspårning. I omvänd MARCM placeras mutationen av intresse på samma kromosom som GAL80, så att de homozygota klonerna av vildtyp kommer att märkas. Flip-Out MARCM framhäver individuella celler inuti mutantkloner (ref "Drosophila Dscam krävs för divergerande segregering av systergrenar och undertrycker ektopisk bifurkation av axoner," Neuron, 2002). Q-systemet tillåter GAL4-oberoende MARCM genom att använda QF/QS-systemet. Dödlig MARCM möjliggör generering av stora markerade homozygota populationer genom att inkludera en dödlig mutation nära GAL80-platsen. Dubbeluttryckskontroll MARCM använder transkriptionssystemet LexA-VP16 i enlighet med GAL4-UAS. MARCM används också ofta som en genetisk screening.