MAGESTISK

Multiplexerad exakt genomredigering med korta, spårbara, integrerade cellulära streckkoder ( MAGESTIC ) är en plattform som bygger på CRISPR /Cas-tekniken. Det förbättrar CRISPR/Cas ytterligare genom att göra genredigeringsprocessen mer exakt. Det ökar också cellöverlevnaden under redigeringsprocessen upp till sju gånger.

Denna teknik uppfanns vid Stanford Genome Technology Center i samarbete med Joint Initiative for Metrology in Biology (JIMB) som är en koalition av Stanford University och National Institute of Standards and Technology .

Översikt

Genredigering används för en mängd olika uppgifter, inklusive modifiering av grödor, modifiering av bakterier och modifiering av sjukdomsframkallande genetiska mutationer hos patienter . När endast en enda redigerad cellinje krävs är CRISPR/Cas i kombination med den endogena DNA-reparationseffektiviteten tillräcklig för att erhålla en redigerad cellinje. Men när man försöker införa många redigeringar i multiplex, krävs en högre effektivitet för Homologi-riktad reparation . MAGESTIC-tekniken har flera komponenter. En komponent, LexA-Fkh1-proteinet, är involverat i processen för donorrekrytering som ökar effektiviteten av homologiriktad reparation. Den andra komponenten är ett bibliotek av CRISPR Guide-RNA parat med donator-DNA som kodar för specificerad redigering för att integreras genom homologiriktad reparation. Detta i sin tur är kopplat till DNA-streckkoder som gör att specifika varianter kan spåras i pooler, liknande hur genomomfattande CRISPR-Cas9 knockout-skärmar fungerar, bara MAGESTIC är mer mångsidig eftersom det inte bara tillåter förlust av funktionsredigeringar, men även DNA- kodonförändringar, enkelnukleotidpolymorfism , Indels och andra typer av genetiska förändringar som ska introduceras och spåras. Genom att förbättra DNA-reparationseffektiviteten, använda arraysyntetiserade guide-donatoroligo för den plasmidbaserade högkapacitetsredigeringen och integrera en genomisk streckkod för att förhindra förlust av plasmidstreckkod, leder MAGESTIC till mer enhetliga pooler med genomintegrerade stabila enkelkopia streckkoder och möjliggör robust fenotypning.

Givarrekrytering

Eftersom redigering av flera platser i pooler kan påverkas av ett antal faktorer, inklusive ineffektivt CRISPR Guide RNA , DNA-syntesfel , konkurrens med icke-homolog ändkoppling och andra utmaningar som uppstår när man bygger multiplexbibliotek, krävde MAGESTIC-skärmar förbättrad DNA-reparation. Det är här givarrekryteringsaspekten av MAGESTIC kommer in. MAGESTIC uppnår större redigeringseffektivitet genom att lokalisera donator-DNA till platsen för DNA-avbrott som introducerats av ett CRISPR-snitt.

Ett CRISPR-maskineri skär på önskade platser i genomet och MAGESTIC dirigerar sedan donatorns DNA till platsen för detta snitt för att styra cellerna för att införa designade redigeringar vid DNA-klippningsställena. Denna teknik kallas donorrekrytering och bygger på ett fusionsprotein som innehåller en domän som rekryteras till DNA-brytningar och en annan domän som binder till donatorns DNA. Detta möjliggör produktion av högkvalitativa precisionsredigeringspooler i jäst, där varje cell innehåller en enda redigering och en DNA-streckkod. Givarrekryteringsaspekten av teknologin har också potentialen att förbättra redigeringseffektiviteten i ytterligare celltyper, såsom däggdjursceller. Detta kan en dag visa sig vara fördelaktigt för genterapier eller annan terapeutisk redigering.