Kakel array
Kakelmatriser är en undertyp av mikroarraychips . Liksom traditionella mikromatriser fungerar de genom att hybridisera märkta DNA- eller RNA -målmolekyler till prober fixerade på en fast yta.
Plattläggningsmatriser skiljer sig från traditionella mikromatriser i probernas natur. Istället för att sondera efter sekvenser av kända eller förutspådda gener som kan vara spridda genom genomet , undersöker plattsättningsarrayer intensivt efter sekvenser som är kända för att existera i en angränsande region. Detta är användbart för att karakterisera regioner som är sekvenserade, men vars lokala funktioner i stort sett är okända. Plattläggningsmatriser hjälper till vid transkriptomkartläggning såväl som vid att upptäcka platser för DNA/ proteininteraktion ( ChIP-chip , DamID ), DNA- metylering (MeDIP-chip) och känslighet för DNase (DNase Chip) och array CGH. Förutom att detektera tidigare oidentifierade gener och regulatoriska sekvenser är förbättrad kvantifiering av transkriptionsprodukter möjlig. Specifika sonder finns i miljontals kopior (i motsats till bara flera i traditionella arrayer) inom en arrayenhet som kallas en funktion, med allt från 10 000 till mer än 6 000 000 olika funktioner per array. Variabla kartläggningsupplösningar kan erhållas genom att justera mängden sekvensöverlappning mellan prober, eller mängden kända baspar mellan sondsekvenser, såväl som sondlängd. För mindre genom som Arabidopsis kan hela genom undersökas. Kakelmatriser är ett användbart verktyg i genomomfattande associationsstudier .
Syntes och tillverkare
De två huvudsakliga sätten att syntetisera plattsättningsarrayer är fotolitografisk tillverkning och mekanisk spotting eller tryckning.
Den första metoden involverar in situ -syntes där sonder, cirka 25 bp, byggs på chipets yta. Dessa arrayer kan innehålla upp till 6 miljoner diskreta funktioner, som var och en innehåller miljontals kopior av en sond.
Det andra sättet att syntetisera plattsättningsarraychips är genom att mekaniskt skriva ut sonder på chipset. Detta görs genom att använda automatiserade maskiner med stift som placerar de tidigare syntetiserade sonderna på ytan. På grund av stiftens storleksbegränsning kan dessa marker rymma upp till nästan 400 000 funktioner. Tre tillverkare av plattsättningar är Affymetrix , NimbleGen och Agilent . Deras produkter varierar i sondlängd och avstånd. ArrayExplorer.com är en gratis webbserver för att jämföra plattsättningar.
Applikationer och typer
Chip-chip
Chip-chip är en av de mest populära användningsområdena för plattsättningsmatriser. Kromatin-immunfällning gör att bindningsställen för proteiner kan identifieras. En genomomfattande variation av detta kallas ChIP-on-chip. Proteiner som binder till kromatin är tvärbundna in vivo , vanligtvis via fixering med formaldehyd . Kromatinet fragmenteras sedan och exponeras för antikroppar specifika mot proteinet av intresse. Dessa komplex fälls sedan ut. DNA:t isoleras sedan och renas. Med traditionella DNA-mikroarrayer hybridiseras det immunutfällda DNA:t till chipet, som innehåller sönder som är utformade för att täcka representativa genomregioner. Överlappande prober eller prober i mycket nära anslutning kan användas. Detta ger en opartisk analys med hög upplösning. Förutom dessa fördelar visar plattsättningsarrayer hög reproducerbarhet och med överlappande prober som spänner över stora segment av genomet, kan plattsättningsarrayer förhöra proteinbindningsställen, som hyser upprepningar. ChIP-chip-experiment har kunnat identifiera bindningsställen för transkriptionsfaktorer över genomet i jäst, drosophila och några få däggdjursarter.
Transkriptomkartläggning
En annan populär användning av plattsättningsmatriser är att hitta uttryckta gener. Traditionella metoder för genförutsägelse för annotering av genomiska sekvenser har haft problem när de används för att kartlägga transkriptomet, som att inte producera en korrekt struktur av generna och även sakna transkript helt. Metoden att sekvensera cDNA för att hitta transkriberade gener stöter också på problem, som att misslyckas med att upptäcka sällsynta eller mycket korta RNA-molekyler, och så upptäcker inte gener som är aktiva endast som svar på signaler eller specifika för en tidsram. Kakelmatriser kan lösa dessa problem. På grund av den höga upplösningen och känsligheten kan även små och sällsynta molekyler detekteras. Den överlappande naturen hos proberna tillåter också detektion av icke-polyadenylerat RNA och kan ge en mer exakt bild av genstrukturen. Tidigare studier på kromosom 21 och 22 visade styrkan hos plattsättningar för att identifiera transkriptionsenheter. Författarna använde 25-mer sönder som var 35 bp från varandra och spänner över hela kromosomerna. Märkta mål framställdes från polyadenylerat RNA. De hittade många fler transkriptioner än förutspått och 90% var utanför kommenterade exoner . En annan studie med Arabidopsis använde högdensitetsoligonukleotidmatriser som täcker hela genomet. Mer än 10 gånger fler transkript hittades än vad som förutspåtts av ESTs [ förtydligande behövs ] och andra förutsägelseverktyg. Nya transkript hittades också i de centromera regionerna där man trodde att inga gener uttrycks aktivt. Många icke-kodande och naturliga antisens-RNA har identifierats med hjälp av plattsättningsmatriser.
MeDIP-chip
Methyl-DNA immunoprecipitation följt av tiling array möjliggör kartläggning och mätning av DNA-metylering över genomet. DNA metyleras på cytosin i CG-dinukleotider på många ställen i genomet. Denna modifiering är en av de bäst förstådda ärftliga epigenetiska förändringarna och har visat sig påverka genuttrycket. Kartläggning av dessa platser kan lägga till kunskapen om uttryckta gener och även epigenetisk reglering på en genomomfattande nivå. Tiling array-studier har genererat högupplösta metyleringskartor för Arabidopsis-genomet för att generera den första "metylomen".
DNase-chip
DNase-chip är en applikation av tiling-arrays för att identifiera överkänsliga platser, segment av öppet kromatin som lättare klyvs av DNaseI. DNasI-klyvning producerar större fragment med en storlek på omkring 1,2 kb. Dessa överkänsliga ställen har visat sig exakt förutsäga regulatoriska element såsom promotorregioner, förstärkare och ljuddämpare. Historiskt sett använder metoden Southern blotting för att hitta digererade fragment. Plattläggningsmatriser har gjort det möjligt för forskare att tillämpa tekniken på en genomomfattande skala.
Jämförande genomisk hybridisering (CGH)
Array-baserad CGH är en teknik som ofta används inom diagnostik för att jämföra skillnader mellan typer av DNA, såsom normala celler vs cancerceller. Två typer av plattsättningsmatriser används vanligtvis för array CGH, hela genomet och finkaklat. Helgenomet tillvägagångssätt skulle vara användbart för att identifiera kopienummervariationer med hög upplösning. Å andra sidan skulle finkaklad array CGH producera ultrahög upplösning för att hitta andra abnormiteter såsom brytpunkter.
Procedur
Det finns flera olika metoder för att kakla en array. Ett protokoll för att analysera genuttryck involverar först isolering av totalt RNA. Detta renas sedan från rRNA-molekyler. RNA:t kopieras till dubbelsträngat DNA, som därefter amplifieras och in vitro transkriberas till cRNA. Produkten delas upp i triplikat för att producera dsDNA, som sedan fragmenteras och märks. Slutligen hybridiseras proverna till plattsättningsarraychipset. Signalerna från chippet skannas och tolkas av datorer.
Olika mjukvara och algoritmer finns tillgängliga för dataanalys och varierar i fördelar beroende på tillverkaren av chipet. För Affymetrix-chips är den modellbaserade analysen av tiling-array (MAT) eller hypergeometrisk analys av tiling-arrays (HAT) effektiva toppsökande algoritmer. För NimbleGen-chips är TAMAL mer lämpligt för att lokalisera bindningsställen. Alternativa algoritmer inkluderar MA2C och TileScope, som är mindre komplicerade att använda. Algoritmen Joint binding deconvolution används vanligtvis för Agilent-chips. Om sekvensanalys av bindningsställe eller annotering av genomet krävs används program som MEME, Gibbs Motif Sampler, Cis-regulatory element annotation system och Galaxy .
Fördelar och nackdelar
Tiling arrays ger ett opartiskt verktyg för att undersöka proteinbindning, genuttryck och genstruktur i ett genomomfattande omfång. De tillåter en ny nivå av insikt i att studera transkriptomen och metylomen.
Nackdelarna inkluderar kostnaden för plattsättningssatser. Även om priserna har fallit under de senaste åren, gör priset det opraktiskt att använda genomomfattande plattsättningsarrayer för däggdjurs- och andra stora genom. En annan fråga är "transkriptionsbruset" som produceras av dess ultrakänsliga detektionsförmåga. Vidare ger tillvägagångssättet ingen tydligt definierad start eller stopp för områden av intresse som identifieras av arrayen. Slutligen ger arrayer vanligtvis endast kromosom- och positionsnummer, vilket ofta kräver sekvensering som ett separat steg (även om vissa moderna arrayer ger sekvensinformation.)