Interferometrisk spridningsmikroskopi

Typiska iSCAT-konfigurationer där antingen det reflekterade ljuset från täckglaset (a, c) eller det transmitterade ljuset genom provet (b, c) används som referensfält. Signalen kan inhämtas med en kamera i bredfältsdrift (a, b) eller genom punktdetektering i konfokalt arrangemang (c, d).

Interferometrisk spridningsmikroskopi ( iSCAT ) hänvisar till en klass av metoder som detekterar och avbildar ett subvåglängdsobjekt genom att störa ljuset som sprids av det med ett referensljusfält. Den underliggande fysiken delas av andra konventionella interferometriska metoder som faskontrast eller differentiell interferenskontrast , eller reflektionsinterferensmikroskopi. Nyckelegenskapen hos iSCAT är detekteringen av elastisk spridning från subvåglängdspartiklar, även känd som Rayleigh-spridning , förutom reflekterade eller sändningssignaler från övervåglängdsobjekt. Vanligtvis är utmaningen att detektera små signaler ovanpå stora och komplexa, fläckliknande bakgrunder. iSCAT har använts för att undersöka nanopartiklar som virus, proteiner, lipidvesiklar, DNA, exosomer, metallnanopartiklar, halvledarkvantpartiklar, laddningsbärare och enstaka organiska molekyler utan behov av en fluorescerande märkning.

Historisk bakgrund

Interferensprincipen spelar en central roll i många avbildningsmetoder, inklusive ljusfältsavbildning eftersom den kan beskrivas som interferensen mellan belysningsfältet och det som har interagerat med objektet, det vill säga genom utsläckning. Faktum är att även mikroskopi baserad på interferens med ett externt ljusfält är mer än hundra år gammal.

De första mätningarna av iSCAT-typ utfördes i biofysiksamhället på 1990-talet. En systematisk utveckling av metoden för detektion av nanoobjekt startade i början av 2000-talet som ett allmänt försök att utforska fluorescensfria alternativ för att studera enskilda molekyler och nanoobjekt. I synnerhet guldnanopartiklar ner till en storlek av 5 nm via interferensen av deras spridda ljus med en reflekterad stråle från täckglaset som stödde dem. Användning av en superkontinuumlaser gjorde det dessutom möjligt att registrera partiklarnas plasmonspektra. De tidiga mätningarna begränsades av kvarvarande fläckliknande bakgrund. Ett nytt tillvägagångssätt för bakgrundssubtraktion och akronymen iSCAT introducerades 2009. Sedan dess har en rad viktiga arbeten rapporterats av olika grupper. Framför allt har ytterligare innovationer inom bakgrunds- och brusdämpning lett till utvecklingen av nya kvantifieringsmetoder såsom massfotometri (ursprungligen introducerad som iSCAMS), där ultrakänslig och exakt interferometrisk detektion omvandlas till ett kvantitativt sätt att mäta molekylmassan hos enskilda biomolekyler .

Teoretisk bakgrund

När ett referensljus överlagras med ett objekts spridda ljus, kan intensiteten vid detektorn beskrivas med,

$I_{det}\propto |{\overline {E_{r}}}+{\overline {E_{s}}}|^{ 2}=I_{r}+I_{s}+2E_{r}E_{s}\cos \phi$

där ${\textstyle {\overline {E_{r}}}=E_{r}e^{i\phi _{r}}}$ och ${\displaystyle {\overline {E_{s}}}=E_{s}e^{i\phi _{s}}} är$ de komplexa elektriska fälten för referensen och det spridda ljuset. De resulterande termerna är referensstrålens intensitet ${\displaystyle (I_{r}=|{\overline {E_{r}}}|^{2})} ,$ den rent spritt ljus från objektet $(I_{s}=|{\overline {E_{s}}}|^{2})$ och korstermen $(2E_{r}E_{s}\cos \phi )$ som innehåller en fas $\phi =\phi _{r }-\phi _{s}$ . Denna fas innefattar en Gouy-faskomponent från variationerna av vågvektorerna, en spridningsfaskomponent från objektets materialegenskaper och en sinusmodulerande faskomponent som beror på partikelns position.

I allmänhet kan referensstrålen ta en annan väg än det spridda ljuset inom den optiska uppställningen, så länge de är koherenta och stör detektorn. Tekniken blir dock enklare och mer stabil om båda strålarna delar samma optiska väg. Därför används typiskt det reflekterade ljuset från täckglaset eller den transmitterade strålen genom provet som referens. För att störningen ska uppstå är det nödvändigt att båda ljusvågorna (spritt ljus och referensljus) är koherenta. Intressant nog behövs vanligtvis inte en ljuskälla med en stor koherenslängd i storleksordningen meter eller mer (som i moderna smalbandiga lasersystem). I de vanligaste iSCAT-förverkligandesystemen där det reflekterade ljuset från ett täckglas används som referens och spridningspartikeln inte är mer än några hundra nanometer ovanför glaset, kan till och med "osammanhängande" ljus, t.ex. från lysdioder, vara Begagnade.

Ansökningar

iSCAT har använts i flera applikationer. Dessa kan grupperas ungefär som:

Etikettfri bildbehandling

• Mikrotubuli
• Lipid nano/mikrodomäner
• Enkel virussamling
• Tidsberoende iSCAT (StroboSCAT)

Spårning av enstaka partiklar

• Enkel virusspårning in vitro
• Spårning av enstaka virus under tidigt skede av infektion i celler
• Mikrosekundsspårning av enstaka partiklar på ett levande cellmembran
• Motorproteinspårning

Etikettfri enstaka molekyldetektion, avbildning, spårning och kvantifiering

• Enstaka molekyldetektion genom absorption
• Enkel proteinavkänning
• Enkel proteinspårning
• Massfotometri

Jonspårning

• Enstaka joner som går in i/ut från batterikatoden