Friflödeselektrofores

Friflödeselektrofores (FFE) , även känd som bärarfri elektrofores , är en matrisfri elektroforetisk separationsteknik. FFE är en teknik som är analog med kapillärelektrofores , med en jämförbar upplösning, som kan användas för vetenskapliga frågor, där semi-preparativa och preparativa mängder prover behövs. Den används för att kvantitativt separera prover enligt skillnader i laddning eller isoelektrisk punkt. På grund av teknikens mångsidighet finns det ett brett utbud av protokoll för separering av prover som sällsynta metalljoner , proteinisoformer , multiproteinkomplex , peptider , organeller , celler , DNA-origami , blodserum och nanopartiklar . Fördelen med FFE är den snabba och skonsamma separationen av prover lösta i ett flytande lösningsmedel utan behov av en matris, som polyakrylamid vid gelelektrofores . Detta säkerställer en mycket hög återvinningshastighet eftersom analyter inte vidhäftar till någon bärare eller matrisstruktur. På grund av dess kontinuerliga natur och höga volymgenomströmning tillåter denna teknik en snabb separation av preparativa mängder prover med en mycket hög upplösning. Vidare kan separationerna utföras under naturliga eller denaturerande betingelser.

Historia

FFE utvecklades på 1960-talet av Kurt Hannig vid Max-Planck-Institutet i Tyskland. Fram till 1980-talet var det en standardiserad teknik för separation av celler och organeller , och FFE testades till och med i rymden för att minimera sedimentationen under noll gravitation . Eftersom flödescytometri blev standardmetoden för cellsortering fokuserade FFE-utvecklingen på separation av proteiner och laddade partiklar. Vissa grupper arbetar också med miniatyriserade versioner av FFE-system eller mikro-FFE.

Metod

Separationskammaren består av en bakplatta och en frontplatta. Bakplattan består vanligtvis av ett kylt aluminiumblock, täckt med en plastklädd glasspegel. Frontplattan är numera gjord av PMMA , tidigare har glas använts. Avståndet mellan front- och bakplattan kan justeras med distanser och är vanligtvis mellan 0,1 - 0,5 mm. Frontplattan innehåller även inloppen för separationsbuffertarna och provet, utloppen för fraktioneringsrören och platinatrådarna som elektroder. Genom att applicera olika buffertar över de multipla buffertinloppen kan operatören ändra pH, saltkoncentrationer eller sammansättning och därmed separationsförhållandena över kammarens bredd. Separationsbuffertarna och provet appliceras med peristaltiska pumpar för att säkerställa ett laminärt flöde . Ett elektriskt högspänningsfält appliceras vinkelrätt mot det laminära flödet. Analyter i det laminära flödet kan separeras med laddningstäthet och/eller isoelektrisk punkt . På grund av sin mycket mångsidiga natur kan denna teknik använda sig av olika metoder för elektrofores, som till exempel isotakofores, isoelektrisk fokusering eller (intervall)zonelektrofores.

I slutet av separationscellen delas det separerade provet upp vid fraktioneringsrören och samlas upp i mikrotiterplattor.

Schematisk funktionalitet av friflödeselektrofores

Efteråt kan proverna karakteriseras med alla större tekniker som HPLC , LC-MS , masspektrometri ( ESI / MALDI , beroende på vilket protokoll som används) eller elektrofores (IEF/ SDS PAGE , 2D-PAGE ).

Ansökningar

Standardapplikationer inkluderar högupplöst separation av proteinkomplex, membranproteiner, protein- och antikroppisoformer, celler, subcellulära avdelningar (som organeller, ribosomer) och liposomer. Genom att använda mycket platta pH-gradienter, genererade av amfolyter , är det möjligt att separera proteinisoformer, som varierar med mindre än 0,02 pH-enheter, med en genomströmning på cirka 3 mg/h. Det är också möjligt att lägga till tillsatser till buffertarna, för att öka upplösningen eller denaturera proverna. Typiskt koncentrationer av urea upp till 8M, 0,1-1% av tvättmedel som: CHAPS, CHAPSO, Digitonin, Dodecyl-ß-D-maltosid, Octyl-ß-D-glukosid, Triton-X-114 (IEF) och DTT upp till 50 mM tolereras.

Nyckelfunktioner

Matrisfri separation, idealisk för att bevara proteinaktivitet/proteinkomplex
Högupplöst separation av proteinkomplex, membranproteiner, proteinisoformer, celler, subcellulära avdelningar (som organeller, ribosomer, etc.),
Separationsstorleken sträcker sig från joner till kompletta celler
Provåtervinning upp till 99 %, beroende på prov och driftsätt
Hög reproducerbarhet av enskilda körningar
Separation på flera minuter
Protokoll för isoelektrisk fokuseringsseparation med olika kommersiella amfolyter och atoxiska småmolekylära ProLytesTM för direkt klinisk tillämpning
Snabb och känslig detektering av separationskvalitet via UV, IEF-geler
Kompatibel med många andra nedströmstekniker, t.ex. HPLC, MS, SDS-, IEF- och 2D-GE
Lämplig för separation av instabila proteiner på grund av kylning av prover och separationskammare ner till 4 °C
Minskning av proteomets komplexitet före ytterligare proteomanalys
Anrika proteiner med låg mängd genom att ta bort överskott av oönskade proteiner
Kompatibel med stora och små provvolymer från cirka 50 µL upp till flera milliliter.
Förberedande såväl som analytiska driftlägen
Stöder alla elektroforetiska separationslägen (IEF, IZE, ZE, ITP)
Kan köras under naturliga eller denaturerande förhållanden

externa länkar