Fluorescerande in situ sekvensering

FISSEQ i fibroblastceller . Varje fläck är en RNA-molekyl omvänt transkriberad och amplifierad. Fläckfärgen indikerar basen . Bilden representerar en cykel i en sekvenseringskörning . 30 cykler skulle ge 30 baser av RNA-sekvensen. Skalstapel 20um.

Fluorescerande in situ-sekvensering ( FISSEQ ) är en metod för att sekvensera en cells RNA medan det finns kvar i vävnad eller kultur med hjälp av nästa generations sekvensering .

Introduktion

FISSEQ kombinerar det rumsliga sammanhanget för RNA- FISH och den globala transkriptomprofileringen av RNA-seq . FISSEQ bevarar vävnaden och tillåter lokalisering av enstaka molekyler in situ RNA. Grunden för metoden är en ny konstruktionsmetod för nukleinsyrasekvenseringsbibliotek som stabilt tvärbinder cDNA- amplikoner i biologiska prover. Sekvenseringsdata genereras sedan genom ett intensivt interfolierat mikroskopi och biokemiprotokoll och efterföljande bildbehandling och bioinformatik. FISSEQ är kompatibel med olika provtyper inklusive cellkultur, vävnadssnitt och hela embryon. FISSEQ är ett exempel på en extremt tät form av nukleinsyraavläsning på plats: varje bokstav längs RNA-kedjan läses. Således kan streckkoder för FISSEQ packas i en kort sträng av DNA, så korta som 15-20 nukleotider långa för mushjärnan eller 5 nukleotider för riktade cancergenpaneler.

Metoder

FISSEQ Schematisk: En taggad slumpmässig hexamer-primer används för att prima M-MuLV omvänt transkriptas för att generera aminoallyl dUTP-modifierade cDNA- fragment i fixerade celler eller vävnader från RNA. BS(PEG)9 tvärbinder permanent det modifierade cDNA:t och den cellulära proteinmatrisen. Efter cDNA-cirkularisering genererar Phi29 DNA-polymeras cDNA- amplikoner . Amplikoner i 3D in situ RNA sekvenserade i cellen.

I FISSEQ utförs en serie biokemiska bearbetningssteg, såsom DNA-ligationer eller enkelbas-DNA-polymerasförlängningar, på ett block av fixerad vävnad, sammanflätad med fluorescerande avbildningssteg. Processen är konceptuellt identisk med mekanismen för fluorescerande sekvensering genom syntes i en kommersiell bulk-DNA-sekvenseringsmaskin, förutom att den utförs i fixerad vävnad. Varje DNA- eller RNA-molekyl i provet "amplifieras" (dvs. kopieras) först in situ via rullande cirkelamplifiering för att skapa en lokaliserad "rullande cirkelkoloni" (roloni) bestående av identiska kopior av modermolekylen. En serie biokemiska steg utförs sedan. I den k:te cykeln introduceras en fluorescerande tagg, vars färg motsvarar identiteten på den k:te basen längs rolonyns moder-DNA-sträng. Systemet "pausas" sedan i detta tillstånd för avbildning. Hela provet kan avbildas i varje cykel. De fluorescerande taggarna klyvs sedan och tvättas bort, och nästa cykel initieras. Varje rolony – motsvarande en enda "förälder"-DNA- eller RNA-molekyl i vävnaden - uppträder alltså över en serie fluorescerande bilder, som en lokaliserad "fläck" med en sekvens av färger som motsvarar modermolekylens nukleotidsekvens. Nukleotidsekvensen för varje DNA- eller RNA-molekyl läses således ut in situ via fluorescerande mikroskopi.

Historia

Utvecklingen av FISSEQ började för över ett decennium sedan. De underliggande principerna liknar de som inledde sekvensrevolutionen. I både bulk high-throughput-sekvensering och FISSEQ amplifieras korta sekvenser lokalt och avbildas sedan en nukleotid i taget. Men kravet på att sekvensera RNA i intakt vävnad – snarare än isolerat och renat DNA, som vid konventionell bulksekvensering – utgjorde ytterligare utmaningar. Dessa begränsningar övervanns och FISSEQ tillåter gemensam, högkapacitetsavläsning av sekvens- och rumsinformation.

Se även