Fluorescens intensitet sönderfall form mikroskopi

Inom den vetenskapliga studien av en molekyls färg är fluorescensintensitetsavfallsformmikroskopi (FIDSAM) en fluorescensmikroskopiteknik , som använder tidsutvecklingen av fluorescensemission efter en pulsad excitation för att analysera sönderfallsstatistiken för en exciterad kromofor . Den huvudsakliga tillämpningen av FIDSAM är diskrimineringen av ospecifik autofluorescerande bakgrundssignal från målsignalen för en dedikerad kromofor.

Princip

FIDSAM-metoden analyserar antalet olika molekyler som bidrar till en uppmätt fluorescenssignal. Om man antar en ren fluorescerande färglösning i en isotrop omgivning är de individuella strålarna omöjliga att särskilja. Följaktligen följer de samma fluorescensemissionsstatistik och tidsutvecklingen för fluorescensemissionen efter en pulsad excitation kan beskrivas med en monoexponentiell avklingningsfunktion enligt:

$F(t)=Ae^{-t/\tau }$

med $A$ = den initiala fluorescensintensiteten efter excitationen och $\tau$ = sönderfallskonstanten (fluorescenslivslängd).

Däremot består autofluorescerande bakgrund av en mängd individuella sändare, som följer individuell emissionsstatistik. Följaktligen samplar tidsevolutionen en summering av många individuella sönderfallsstatistik och kan skrivas som:

$F(t)=\summa (A_{1}e^{-t/\tau _{1}})$ .

FIDSAM-tekniken baseras på en tidskorrelerad enkelfotonräkning (TCSPC) mätning och analyserar graden av avvikelse för en registrerad fluorescensavklingning från ett monoexponentiellt beteende. Detta uppnås genom att anpassa den registrerade fluorescensintensitetsavklingningen med en monoexponentiell sönderfallsfunktion som är invecklad med instrumentets svarsfunktion. I ett nästa steg extraheras felvärdet för anpassningsproceduren, ${\displaystyle \chi ^{2}} ,$ och dess inversa värde multipliceras med det ursprungliga intensitetsvärdet. På så sätt delas fluorescenssignalen, som härrör från autofluorescensbakgrunden och därför uppvisar ökade felvärden, med ett relativt stort antal, medan fluorescenssignalen från målmolekyler uppvisar små felvärden runt enhet delas med ett litet tal och förblir i stort sett opåverkad .

FIDSAM bildbehandling

Typiskt tillämpas FIDSAM-tekniken på en mikroskopiavbildning. Medan mätprotokollet är lika med fluorescenslivstidsavbildningsmikroskopi (FLIM), är avläsningsparametern annorlunda. I FLIM härleds den karakteristiska avklingningskonstanten , medan FIDSAM analyserar formen på fluorescensintensitetsavfallet via felvärdet. På grund av detta är FIDSAM i sig inte beroende av fluktuationer i fluorescenslivslängden, som ofta uppstår på grund av den individuella kemiska omgivningen av en kromofor, utan på analys av isotropin hos de bidragande strålarna i en given provvolym.